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技术资料/正文
Western Blot 常见问题排除
288 人阅读发布时间：2022-06-10 13:15
免疫印迹，通常也叫Western Blot，是一种蛋白研究的基本技术，虽然每个实验室都有自己的方法，但基本的步骤大致相同，然而，对一种应用的熟悉，并不保证会得到干净又可发表于文献的结果，获得无背景值的漂亮信号常常需要系统性的问题排除，才能够快速且正确的改善糟糕结果，因此，我们将免疫印迹整个过程中可能刚出现的问题列出来，并针对这些问题提供解决方案。
| 问题 | 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 转膜不充分 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
| 靶蛋白分子量小于10kDa | 选择小孔径的膜，缩短转移时间 | |
| 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值 | 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（PH10.5）或使用低PH值缓冲液如乙酸缓冲液 | |
| 甲醇浓度过高 | 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移，降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 | |
| 转移时间不够 | 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 | |
| 背景高 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
| 洗膜不充分 | 增加洗液次数和洗液体积 | |
| 封闭不充分 | 增加封闭液孵育时间，或者提高温度，选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BS，,酪蛋白等） | |
| 二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 | |
| 检测过程中膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 | |
| 曝光过度 | 缩短曝光时间 | |
| 抗体与封闭蛋白有交叉反应 | 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂，洗涤剂中加入Tween-20可减少交叉反应 | |
| 二抗的非特异性背景 | 增加一个二抗对照：不加一抗，其它条件不变，即可验证背景是否有二抗系统来源。选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） | |
| 无信号 | 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明失活，选择在有效期内有活性的酶联物 | |
| 标本中不含靶蛋白或靶蛋白蛋白太低 | 设置阳性对照，如果阳性对照， | |
| 试剂之间不匹配 | 一抗与标本种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配，通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性 | |
| 一抗失效 | 选择有效期内抗体，并选择现配现用的工作液 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有 | |
| 弱信号 | 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶活性降低 | 直接将酶和底物进行混合，如果显色弱则说明酶活性降低了。选择在有效期内，有活性的酶联物 | |
| 标本中靶蛋白含量太低 | 增加标本上样量 | |
| 洗膜过度 | 缩短洗涤时间和次数 | |
| 抗体活性降低 | 选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 | |
| 封闭过度 | 较少封闭剂的量或缩短时间；更换不同封闭类型 | |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有 | |
| 非特异性条带（多条带） | 二抗的非特异性结合 | 增加一个二抗对照（不加一抗，其它操作不变）即可验证背景是否由二抗系统来源；选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） |
| 一抗特异性不够 | 使用单克隆或者亲和纯化抗体，保证抗体的特异性 | |
| 蛋白降解 | 使用新鲜制备的抗体，并使用蛋白酶抑制剂 | |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 | |
| 不同剪切体的存在 | 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的 | |
| 细胞传代过多导致蛋白变异 | 使用原代或传代的细胞作对照 | |
| 蛋白上样量过大 | 降低上样量 | |
| 条带大小不对 | 二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 |
| 翻译后剪切 | 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能是需要进行剪切成活化的形式，如procaspases | |
| 蛋白修饰 | 比如氨基化、磷酸化等修饰状态回导致蛋白分子量增加 | |
| 背景有黑色斑点 | 封闭试剂中有聚集体 | 使用前过滤封闭试剂 |
| 孵育液中有聚集体 | 使用前过滤孵育液 | |
| 抗体和封闭试剂反应 | 使用前过来吧封闭试剂 | |
| HRP偶联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂 | |
| 背景有不均匀的白色斑点 | 转膜过程中有气泡产生 | 仔细检查，避免存在气泡 |
| 抗体分布不均匀 | 孵育抗体时使用摇床 | |
| 微小条带 | 电泳速度过快 | 减少电压减慢电泳速度 |
| 电泳速度过高 | 在冷室或冰浴中进行电泳，改变电泳PH值 | |
| 膜出现反像（白色带） | HRP含量过高 | 降低酶联二抗浓度 |
| Marker变黑色 | 抗体和marker蛋白反应 | 在marker和sample之前空出一个孔不上样 |
。
WB实验孵育和检测相关产品推荐：| 实验步骤 | 推荐指数 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
| 一抗孵育 | abs830001 | Anti- GST | 50ul,100ul | |
| abs830002 | Anti- His Tag抗体 | 50ul,100ul | ||
| abs830003 | Anti- His(C-terminal Specific) 抗体 | 50ul,100ul | ||
| abs830004 | Anti- Myc 抗体 | 50ul,100ul | ||
| abs830005 | Anti- DYKDDDDK | 50ul,100ul | ||
| abs830006 | Anti- HA 抗体 | 50ul,100ul | ||
| abs830008 | Anti-V5,mAb | 50ul,100ul | ||
| abs830010 | Anti- GST,HRP | 50ul | ||
| abs830011 | Anti- His Tag (HRP) 抗体 | 50ul | ||
| abs830012 | Anti- His(C-terminal Specific) (HRP) 抗体 | 50ul | ||
| abs830013 | Anti- Myc (HRP) 抗体 | 50ul | ||
| abs830014 | Anti- DYKDDDDK,HRP | 50ul | ||
| abs830015 | Anti- HA (HRP) 抗体 | 50ul | ||
| abs830016 | Anti- V5 (HRP) 抗体 | 50ul | ||
| abs137956 | C-Myc-Tag Mouse Monoclonal Antibody | 50ug,100ug | ||
| abs137958 | Flag-Tag Mouse Monoclonal Antibody | 50ug,100ug | ||
| 显色 | ★★★★★ | abs920 | ECL化学发光检测试剂盒 | 2*25ml,2*50ml,2*250ml |
| abs9212 | DAB 显色试剂盒（棕黄色，WB） | 1kit | ||
| abs9213 | DAB 显色试剂盒（紫蓝色，WB） | 1kit | ||
| 其他辅助试剂 | abs952 | 10*TBST | 100ml,1L | |
| abs9152 | Tween-20 | 500ml | ||
| ★★ | abs954 | WB专用一抗二抗稀释液 | 100ml | |
| abs969 | Western一抗二抗去除液（中性） | 250ml | ||
| abs968 | Western一抗二抗去除液（弱碱性） | 250ml | ||
| abs967 | Western一抗二抗去除液（强碱性） | 250ml | ||
| 新手必备 | ★★★★★ | abs926 | WB solution base kit（rabbit） | 1kit |
| ★★★★★ | abs927 | WB solution base kit（mouse） | 1kit | |
| ★★★★★ | abs928 | WB solution base kit（goat） | 1kit |
ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...