转染前一定要注意的几个地方

2600 人阅读发布时间：2024-12-04 15:13

转染技术是指将外源分子如 DNA、RNA 等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择。

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染。前者外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-96 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（ APH；新霉素抗性基因），潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：

1. 细胞培养物

健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前 24 小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源 DNA 摄入的可能。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。

2. 血清

大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右)试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源 DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。

3. 载体构建

转染载体的构建（病毒载体，质粒 DNA，RNA，PCR 产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性 DNA 对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。

4. DNA 质量

DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果 DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界品牌德国 QIAGEN 公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍 2 x CsCl 梯度离心以上的纯度效果，使您不必为 DNA 质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN 还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。

5.转染技术

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如 DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下：

转染方法、原理及应用

DEAE- 右旋糖苷法带正电的 DEAE- 右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清。

磷酸钙法

磷酸钙 DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染，瞬时性转染不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用。

电穿孔法

高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入稳定转染，瞬时性转染，所有细胞适用性广但细胞致死率高，DNA 和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。

阳离子性的脂质体法

带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染。
瞬时性转染，所有细胞适用性广，转染效率高，重复性好但转染时需除血清。
转染效果随细胞类型变化大。

病毒介导法

逆转录病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染，特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大。
细胞需处分裂期，需考虑安全因素，腺病毒瞬时转染，特定宿主细胞可用于难转染的细胞，需考虑安全因素。

Biolistic 颗粒传递法

将 DNA 用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA 在胞内逐步释放，表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞。

显微注射法

用显微操作将 DNA 直接注入靶细胞核稳定转染，瞬时性转染转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。

pei转染方法

实验原理
直链PEI单体中每3个原子含1个氮，形成胺基。每相隔二个碳原子，即每第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的质子海绵(proton sponge)体。这是PEI有较强的结合DNA和黏附细胞，能作为基因转导载体的重要原因。
PEI 能将 DNA 包裹成带正电荷的微粒，这些微粒能黏合到带有负电荷的细胞表面残基，并通过胞吞作用进入细胞。进入细胞后，胺的质子化导致反离子大量涌入以及渗透势降低，在低pH环境中实现DNA胞内释放。最被接受的观点是PEI上未质子化的胺可以在与膜结合的细胞器（如溶酶体）中吸收氢离子，这将导致更多氢离子的流入，诱发渗透溶胀。而质子化胺之间的排斥引起PEI构象的改变，上述变化导致的渗透膨胀使囊泡释放聚合物与 DNA 形成的复合物进入细胞质。复合物拆解后，DNA 能自由的融合到细胞核中。

实验方法
1．细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以4×105 至8×105细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90％）。根据细胞贴壁情况于含5％ CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前换入2 mL 预热的无血清培养基。
2.制备PEI-DNA 混合物：以60 mm 组织培养皿用420 μL 反应总体积为例。准备两支1.5 mL 离心管，一管将质粒DNA（总量2-8 μg 为佳）加入240 μL HBS中，混匀。另一管中则用HBS 将100 μM 的PEI 储存液稀释成10 μM，充分混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中，充分混匀后室温静置20-30 min。最后将这420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％～7％ CO2 的37℃ 温箱孵育。
注：每次用100 μM 的PEI 储存液前都需要先将其充分混匀，保证所取的浓度一致。
3. 培养6-10 h 后更换为37℃预热的含有血清的培养基，继续培养，16 h 左右可以观测到报告基因的表达。

聚乙xi亚胺“Max” (PEI MAX) 是一种功能强大、值得信赖且具有成本效益的试剂，被广泛认为是目前体外和体内的金标准转染。PEI MAX 具有高密度的可质子化氨基，每三个原子有一个氨基氮。这赋予了几乎在任何 pH 值下的高缓冲能力。因此，一旦进入内体，PEI MAX 就会破坏液泡并将遗传物质释放到细胞质中。与 DNA 的稳定络合、高效进入细胞和逃离内体的能力使 PEI MAX 成为一种高效的转染试剂，适用于多种细胞系/类型，包括最常用的 HEK293 和 CHO 细胞在贴壁和悬浮培养。与市场上其他 PEI 和脂质体转染试剂相比，PEI MAX 能够在不影响细胞活力的情况下产生高效细胞系。

主要优势

卓越的性能：与市场上的其他试剂相比，转染效率高，细胞毒性低，适用于更高浓度和敏感细胞。
低细胞毒性：更大浓度的 PEI MAX 对细胞的破坏最小
高品质：根据 ISO 13485 质量体系在美国采购和制造
灵活的工作流程：易于优化和引入应用协议。可扩展用于孔板、烧瓶和更大容量的生物反应器。
提供 cGMP 级以及粉末和液体两种形式。
成本效益：与市场上类似的转染产品相比，经济实惠。
历史：Polysciences 是制药和医疗设备主要参与者值得信赖的合作伙伴，在特种化学品制造领域拥有 60 多年的经验。十多年来，数以千计的客户在其研发中使用了 PEI MAX。

POLYSCIENCES 的 PEI MAX 产品在转染后 72 小时后产生高滴度的 AVV

转染含有 30mL 1×10^6 细胞/mL 悬浮 HEK293 细胞培养物的烧瓶以产生 rAAV8 CMV-eGFP。rAAV8 在转染后 48 小时从培养基中收获，随着时间的推移，在培养基中发现的载体数量不断增加（Griger 2015）。

产品名称:	PEIMax转染试剂、PEI Max转染试剂，PEIMax MW40000、PEI Max MW40000，PEIMax 40K、PEI Max 40K，Polyethylenimine、线性聚亚胺、线性PEI、转染级别PEI
英文名称:	PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) (Polysciences#24765-1 1g; Polysciences#24765-100 100mg) PEIMAX 24765 PEI Max 24765
规格:	100mg，1 g, 1 ml，
产品目录号:	PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) 100mg Polyscience#24765-100 PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) 1g Polyscience#24765-1 MaxFect Transfection Regent 1ml Biofeng# A609
贮存条件:	避光，-20度
CAS号:	PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) CAS Number: 49553-93-7 MaxFect Transfection Regent CAS Number: 49553-93-7
物理性状:	固体为白色或近白色粉末。 1 mg/mL水溶液透明，接近无色或略显黄色。
用途:	细胞培养级别的质粒转染。本产品仅供科研使用，不能用于临床治疗。
PEI MW25000和PEI Max MW40000区别：	PEI MAX MW40000 ( Polysciences#24765-1)是线性化聚烯亚胺PEI MW25000(Polysciences#23966-1)的升级产品，是一种功能更为强大的高效瞬时转染试剂。PEI MAX MW40000与PEI 25000的区别在于： 1）完全水解（去乙酰化） 2）PEI 25000的盐酸盐形式，具更高的水溶特性 3）含更长连续性乙亚胺片段，其转染效率比PEI MW25000提高11%以上。 4）PEI MAX 40K比PEI 25K更易于使用，并且更高效。PEI 25K转染溶液通常需要几个小时才能制备，而PEI MAX 40K可以在两个小时内转化为即用型可溶性溶液。 5）PEI 25K含有4-11%的残余丙酰基，可防止聚合物主链与DNA强烈结合。PEI MAX 40K完全去乙酰化的结构意味着每批产品的表现始终如一，稳定性更强。
储存浓度:	1 mg/ml
工作浓度:	3 ug/ml 左右，每ml培养基加入3 ul储存液。
PEI转染试剂配置方法：	1. 称取100mg PEI转染试剂，溶解于100ml无菌水中。配置的终浓度是1 mg/ml. 2. 缓慢使用稀盐酸，调节PH至7.0，一定不要让pH过了，一旦过了效果就不好了。 3. 使用0.1um或者0.22um无菌过滤器，过滤除菌。 4. 分装成每管500ul-1ml，-20度，保存，备用。 5. 使用超纯水配置，器具一定要灭菌干净，防止支原体污染。
适用范围:	本产品适用于绝大多数真核细胞质粒转染：HEK 293，293T，A549，B16F10，HeLa，Hepa 1-6，Hepa-1c1c7，HepG2，BHK-21，C2C12，C6，CHO-K1，COS-1，COS-7，Daoy，DU 145，K562，KB，LL/2(LLC1)， LNCaP-FGC，MCF-7，MEL，Neuro-2a，NIH3T3，OVCAR-3，PC-3，PC-12等。
细胞培养基:	PEI转染试剂适用于大多数常用细胞培养基，且转染前后不需要更换培养基，血清的存在不影响转染效率。
转染时细胞密度：	一般来说，当细胞密度达到60% - 80%时进行转染可以取得较高的转染效率。然而，不同细胞的最适转染密度都不尽相同。因此在初次转染某种细胞时，可以通过预实验先确认该细胞最佳的转染密度。
转染质粒纯度和浓度：	用于细胞转染的DNA应具有较高的纯度，且无内毒素残留(推荐使用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒抽提)。质粒浓度尽量高一些，建议大于500 ng/ul.
转染比例：	DNA：PEI = 1:3 1ml细胞培养液，建议使用1 ug-3 ug DNA 和3 ul - 9 ul PEI转染试剂储存液。具体根据细胞情况自由调整。在初次转染某种细胞时，推荐PEI和DNA的比例为2:1，即1 μg DNA使用2 μl PEI。转染1 μg DNA所使用的PEI转染试剂剂量可以在1 - 5 μl之间进行调整以获得最佳的转染效率。
转染后细胞培养时间:	对于绝大多数细胞实验而言培养24 - 48 h即可，如实验情况特殊可在12 - 72 h之间进行优化。
细胞转染步骤：	以6孔板细胞培养转染为例: 使用细胞培养液3ml，DNA质粒3ug，PEI转染试剂9ug。可以根据不同细胞特性，增加DNA和PEI使用量。细胞培养 1. 转染前24 h左右对细胞进行传代，接种密度约为1 - 3 × 105 cells/well。细胞接种密度，大约在60%左右。 2. 过夜培养。 3. 吸出培养液，使用新鲜培养液清洗3-4次。然后，加入2.7 ml新鲜配置的完全培养基。因为细胞过夜生长的分泌物有可能影响转染效率，所有建议进行细胞清洗操作。更换新鲜培养液，有助于转染后的细胞表达和生长，防止细胞营养的不足。也可以不吸出培养液，不更换新鲜培养液，直接进行细胞转染。 4. 当细胞汇合度达到60% - 80%时，转染可以取得较高的转染效率。 PEI/DNA复合物配置 1. 在1.5 ml无菌离心管中加入150 μl opti-MEM无血清培养基，并加入3 ug DNA质粒，用移液器轻轻混匀。 2. 在1.5 ml无菌离心管中加入150 μl opti-MEM无血清培养基，并加入9 ug PEI转染试剂储存液，用移液器轻轻混匀。 3. 将PEI-opti-MEM滴加至DNA-opti-MEM中，用移液器轻轻混匀，室温静置15 - 30 min后可用于转染。注意：形成的PEI/DNA复合物溶液尽量在30 min内使用。 4. PEI/DNA复合物的形成，一定是分别在无血清培养基中稀释后，再进行混匀。血清的存在会干扰复合物的形成。细胞转染 1. 将PEI/DNA复合物混合液滴加至6孔板培养基中，轻轻晃动吹打培养液使PEI/DNA复合物均匀分散。 2. 过夜培养24-72小时。
初始转染条件：	pei质粒转染体系
PEI转染效率：	细胞种类中文名称 PEI 转染效率 HEK293 人胚肾细胞 90%-95% 293-T 人胚肾细胞 90%-95% CHO-K1 仓鼠卵巢细胞 80%-90% U251 人源神经胶质瘤细胞 80%-90% Hela 人源宫颈癌细胞 70%-80% COS7 猴 SV40 转化肾细胞 70%-80% HepG2 人源肝癌细胞 70%-80% NIH/3T3 小鼠胚胎成纤维细胞 60%-70% 胶质瘤干细胞人源胶质瘤干细胞 60%-70% Patu8988 人源胰腺癌细胞 60%-70% U2OS 人源骨肉瘤细胞 60%-70%
产品图片：	Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25K™) (Polyscience#23966-1 1g) PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) (Polyscience#24765-1 1g)

PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)
(Polysciences#24765-1 1g; Polysciences#24765-100 100mg)

PEIMAX 24765
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